Molekulaarbioloogiliste uuringute meetodid ja nende kasutamine

Molekulaarbioloogiliste uuringute meetodid on oluline roll kaasaegses meditsiinis, kriminalistika, ja bioloogia. Tänu edusammudele uuringu DNA ja RNA, inimene on võimeline uurida organismi genoomis kindlaks haigustekitaja, tunnustada soovitud nukleiinhappe hapete segu jne

Molecular-bioloogiliste meetoditega. Mis see on?

Tagasi 70-80s teadlaste oli esimene dešifreerida inimgenoomi. See sündmus andis tõuke geenitehnoloogia ja molekulaarbioloogia. Uuring omadused DNA ja RNA on viinud selleni, et nüüd on võimalik kasutada neid nukleiinhappeid eesmärgil haiguse diagnoosimiseks, uuringu geen.

Valmistamine DNA ja RNA

Molekulaarbioloogiliste diagnostikameetodite nõuavad lähteaine: sageli seda nukleiinhapet. On mitmeid viise, et valida need ained rakkudest elusorganismid. Igal neist on oma plussid ja miinused, ja siis tuleb kaaluda valides meetod eraldades nukleiinhapped puhtal kujul.

1. valmistamine DNA Marmur. Meetod seisneb segu töötlemisega alkoholi aineid, sadestub Saadud puhtad DNA. Puuduseks on see meetod on kasutada söövitavate ainetega, fenooli ja kloroformiga.

2. isoleerimine DNA noolekonstruktsioonil. Peamine aine, mida kasutatakse siin - on guanidiintiotsüanaadist (GuSCN). See soodustab sadestumist desoksüribonukleiinhappe kohta spetsialiseerunud substraate, kust seda saab hiljem koguti kasutatakse eri puhvris. Siiski GuSCN - pärsib TCP ja isegi väike osa, mis saab hoiule DNA võib mõjutada käigus polümeraasi ahelreaktsiooni, mis on oluline töötamisel nukleiinhappeid.

3. Sademed lisandite. Meetod erineb eelmistest, et molekulid ise ei hoiule dehoksiribonukleinovoy happe ja lisandeid. Selleks kasutage Ioonvahetite. Puuduseks on, et mitte kõik ained võivad settida.

4. massiuuringu. Seda meetodit kasutatakse juhul, kui sa ei pea olema täpne informatsioon struktuuri DNA molekuli ja vajadust saada veidi statistikat. Põhjuseks on see, et nukleiinhappe struktuuri saab kahjustatud käsitsemisel pesemis-, eriti leelistega.

Klassifikatsioon uurimismeetodite

Kõik molekulaarbioloogiliselt uurimismeetodid jagunevad kolme rühma:

1. Amplification (kasutades arvukate ensüümide). See hõlmab PCR - polümeraasi ahelreaktsiooni, mis mängib olulist rolli paljudes diagnostikameetodite.

2. Neamplifikatsionnye. See rühm meetodeid on otseselt seotud töö nukleiinhappe segud. Näideteks on 3 liiki blottides in situ hübridisatsiooni jne

3. Meetodid põhineb arusaamal, et signaal sondimolekul, mis seondub spetsiifilise DNA või RNA prooviga. Näide - hübridisatsioonisüsteemis hybride salvestussüsteemi lahusega (HC2).

Ensüümid, mida saab kasutada molekulaarbioloogilistes uurimismeetodeid

Paljud molekulaarse diagnostikatehnoloogiad kasutamisega seotud mitmesuguste ensüümidega. Allpool kasutatakse kõige sagedamini:

1. restriktaasi - "lõigatud" DNA molekuli vajalikud osad.

2. DNA polümeraasi - sünteesib kaheahelalise desoksüribonukleiinhappe molekul.

3. pöördtranskriptaas (pöördtranskriptaas) - sünteesiks kasutatud DNA RNA matriitsi.

4. DNA ligaasi - vastutab teket fosfordiestersidet vahel nukleotiidi.

5. eksonukleaasne - eemaldab nukleotiidi otsaosadele desoksüribonukleiinhappe molekul.

PCR - põhimeetodit amplifikatsioonilise

Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) on laialdaselt kasutusel kaasaegsed molekulaarbioloogia. See meetod, milles üks DNA molekul võib saada suure koopiate arv (võimendamise molekuli).

Põhifunktsioonid PCR:

- haiguste diagnoosimiseks;

- kloonimiseks DNA segmendid, Gene.

Teostada polümeraasi ahelreaktsiooni vaja järgmisi elemente: algse DNA molekuli, termostabiilset DNA polümeraasi (Taq või Pfu), desoksüribonukleotiidi fosfaadid (allikad lämmastikalustest) praimereid (2 praimeri 1 DNA molekuli) ja ennast puhversüsteem mis võib teostada kõik reaktsioonid.

PCR koosneb kolmest etapist: denaturatsioon, praimerite lõõmutamine ja venivus.

1. denaturatsiooni. Temperatuuril 94-95 kraadi Celsiuse proshodit murda vahel vesiniksidemeid kahe ahela DNA, ning selle tulemusena saame kahe üheahelaline molekulidega.

2. lõõmutatud praimereid. Temperatuuril 50-60 kraadi toimub ühinemist praimereid otstes üheahelaline nukleiinhappemolekule tüübi kohaselt komplementaarsuse.

3. venivus. Temperatuuril 72 kraadi sünteesitakse tütar kaheahelalise desoksüribonukleiinhappe molekulidega.

DNA sekveneerimise

Molekulaarbioloogiliste uurimismeetodeid nõuavad sageli teadmised nukleotiidide järjestus molekulis desoksüribonukleiinhappe. Et määrata geneetilise koodi sekveneeriti. Molekulaardiagnostika tuleviku põhineb omandatud teadmisi määramisel inimese järjestust.

Järgmist tüüpi Järjestamistegevuse

• järjestamiseks Maxam-Gilberti;
• Sanger sekveneerimine;
• pürosekveneerimise;
• nanoporovoe järjestamisega.